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光子计数荧光偏振仪

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’  0
二一   6   分 析 仪 器  l口年第 2 92 期 

I 血越塑 

业 ‰ 

i 究报告l 研  
‘  j盲   拣  

光 子 计 数 荧 光 偏 振 仪 
Rt . l/ 乐 , e e 郑   .丁一   . I t  ̄ . X 7 ,  
( 中国科 学 院上 海生物 化学研 究所 .上海 .2 o s ) ’ oot    



蔓 。报 导了一 台 自制 的荧 光偏 振仪 .仪 器应用 了光 子计 数 技术, 提高 憧渊 灵 敏 度. 介 绍 了整  以

机 结构 ,对光 子计数 器的三 个 组成 帮 分作 了详 细 说 明 .最 唇介 绍了光 子计数 器 和偏 撮 箍的 调试 方法 .  

关■ 茎 词一  缝堡堡 三主   皇     耋  
荧光 偏振是荧 光光 谱学 中一个 十分重要的  参数 。通过荧光 偏振的渊定可 以研 究荧 光发色  团中激发 跃迁偶极 矩和发射跃 迁偶极矩之间的  相 对夹角, 子的大小 和形 状, 分 进而 可以研 究分  子问的解离、结合和相 互作 用, 因而 在生 物化  学. 生物 物理等学 科中有广 泛的应用“   一。 * 来 我 们 研 制 了一 台荧 光 偏 振 仪 , 并 将 光  子计数 技术应用在该 仪器上 ,取得 了令人满意 
的结 粜 。  

lrz r 美 NOre公 司产 品,光 谱范 围30 ' ie , t il a 0 ~ 

8 O m 和激发偏 振器P 一样 , 5h ) l 装在 一可精确 转  动9度 的机械装置上 ,可 以准确 地将偏 振器置  0
于水 *或垂直方 向上。 电倍 增管P 光 MT采用适  合于光 子计数 器的E  5 8 , 其信号输 出  MI 5  9 QB

端 与光 子计数 器 ( c 相联 。氙 灯 电源为恒流  P)
电源 ,光 电倍 增管的高压 电源为稳压 源。  





整 机 结 构 

/  

仪器采 用  L”形 结构 [ ,其 结构 简图 见  I 1
图 1 由 1 W 氙 灯 发 出 的光 经 石 英 遗 镜 L1 。  0 及 

单 色仪 M后 ,得 到一定波 长的单色光 ,通 过旋 

转 激发 偏振器P1( a - a lr   Gln T y o 棱镜 ,美 国  Or e公司产 品, il 光谱范 围2 o 0 n ,可获  0  ̄8 o m) 得水 *方 向偏 振光 。 石英 透镜L 和L3 2 将单 色偏 
振光 聚焦 到样 品池中心 ,激发样品产生荧光。   F1 带通滤 光 片, 以滤去 单色仪光栅 产生 的  是 用 二级光 谱。样 品发 出的荧光 在 与激发光成 9 度  O 的 方向上进 行检测。 石英 透镜 L 、 将荧光聚  3 L4 焦在光 电倍 增管光 阴极 上, 和L 之 间的滤光  L3 4 片 F 只允 许 需 要 检 测 的 波 长 的 荧 光 通 过 ,而 其  2 它波长 的光 ,包 括激发光 在内 ,均不 能通过。   发 射偏 振 器P ( v Lie rDih o eP — 2 u   n &  c   l  o   r
圈 1 光予 计 散 荧光 啊摄 倪 结构 示意 圈   
x 一 氙灯 e L 一石 英i镜 妻 F 一带通 滤光 片 
l一样品 池 J   P 一偏 撮器 M一单 色谈 

P 一 光 电倍增 营 MT

P 一光 子* 器  c

光 电倍 增管的打拿极分压链略有别于一般  直 流检测中常用的方式 ,最 后三个 打拿 极分别  并联 了一个 0O 2 F 电容,有 助于提 供足够  .0 ̄ 的

I 9年 第 2 g2 期 







器 

7  

的 电荷 , 以缩 短 光 子 产 生 的 电脉 冲 的 上 升 时 间。  

送 出低 电* 。当来 自样 品的荧光 光予撞 击光 电  倍增管 的光 阴极时。产 生 的 光 电 流 脉 j 在  l l t AM6 6 8 输入端 2 形成 电压脉 冲。 当蔼节 3 处 适   端 的甑 别 电压水 *, 即可在 AM6 6 出端 输 出 8输   脉冲信号 。 打拿 极的 电子热发射等也 会使P   MT 产生一定 的 电压脉冲输 出?这是 产生暗 电流曲 

二 、 光 子 计 数 器 
光 子 计 数 器 主 要 出三 部 分组 成 ; 信 号放 大 

电压 比较 电路  脉 冲整 形 电路 ,计数 电路及 有 
关 时基 电 路 。   1.信 号 放 太 电压 比较 电路 

主要原因。但 如果 热发 射发生 在第 二或更后面  的打拿极 ,由于其 电流放大作用 较小,在 2  
处产 生的 电压脉冲较 低。 因此 只要…3 端 电压 
水 * 低 于 信 号 光 子产 生 的 电压 脉 冲 而 高于 电子 

信号放大 及电压 比较 由Ad a c d Mir  v n e  c o  
De ie  v c s AM 6 6 8 芯片 完 成 。 AM 6 6 一 个 高 速  8是

放 大 比较 器 , 可处 理 0 6 l mY, 1 2 5n  .~   0 . ~  s 的 信 号 ,其 输 出 与TTL兼 容 。 电路见 图 2。  

热发射产生 的 电压脉 冲 ,就 可 使 AM6 6 出 8 橱   端 的脉 冲数 只和样 品荧 光 发射有关 , 与P   而 MT
暗 电 流基 本无 关 。   AM6 6 出 的脉 冲 同 时被 送 至 十 分 频 器   8输 7 LS 9的 l5 入 端和 多路 开 关 7 LS 5 4 3o 1输 : 4 I 3的 

C 、3 l C 输入端 。 1个脉 冲可 在7 L¥ 9 的QA 每 O 4 30   输 出端产生 一个脉冲胲 脉冲被送至7 L   3 4 S  输  1 5 入端CO C 。上 述两脉 冲信号是 否在 7 L 1 3 、 2 4 S 5 
的 Y 端 输 出 由除 法 开 关 S的 位置 决 定 。 开 关   断 开 时 , 进 至 Y输 出端 的 脉冲 教 和AM6 6 出  8输


样 ;开 关 接 通 时, 冲 经 十 分 频 后 才 进 至 Y, 脉  

即脉 冲 教 缩 小 1 。 Y 输 出 的 脉 冲 被 送 至  0倍
圈 2 伯号 放 大 电压 比较 电路 

7 L¥ 2 , 生宽 度 为 1 o s 标 准 脉 冲 , 然 后  4 2 1产   n的 0

2 .脉冲整形 电路  脉 冲整形 电路如图 3 所示 。AM6 6   的输入  8 2用来跟踪光 电倍 增管输 出 电压的变化 ,输 
入端 3与可 调 电压 分 压 器 相联 , 以提 供 一 定 的 

经7   5 1 驱动器 通过 同轴 电缆送至计数器计数。 10     图 3 示 电路是 双通道 的, 所 可以同时处 理两路脉 
冲信号。   5 .计 数 电路 和 时 基 电路  

甑别 电压 。当输入端 2 的信号 电压高于输入端  3的 参考 电压 时 , AM6 6送 出 高 电 * , 反 之 则  8

时基控制 电路如图 4 所示 。八 位可 预置 可  逆计数器 ( 图中宋 给出 ,上海晶蜂 电子公司生  产) 由两块 1 M7 1A] 位十进  C 27 2 1 ] 制可逆 计数器配以适当元件和 8   只0 5 . 英寸共 阴七段LE D显示器 
组 成 。 时基 控 制 电 路 主 要 由 四片  5 5 路组 成。 在 电源 接 通 的 同  5电

时 ,Vi 处有低 电*信号 ,触 发  1 第 一片5 5 使其输 出端 出现高电  5,
* , 续 时 祠 由 RI 乘 积 决 定 。 持 C1   通 过 改 变 Rl ,在 V0 处 可 获 得 l 1  
圈 5 脉冲 ■ 形电 路 

至 l0 秒 宽 的 高 电* 信 号 , 经 反  00

相器 1 (4 0 )转换成低 电乎  7 LS 0

8  







器 

I9 年 弟 2期  92

信号, 至 计数器 控 制端 6 ( 电*计 敖, 电  . 送 低 高
* 镁 存 ) 由 计 数 器对 送 来 的 脉 冲 计 数 。 , 当 ̄o 变  t 为 低 电 *时 , 经 反 相 器 l在 计数 器 控 制 端 B处  

三 、仪器 的调试 
1 光 子 计 数 器 的 调节  .

产生 耐 电*, 计数 器停止 计数 并锁 存已计数字 ;   同时, 由于微 分 电容的作用 在第 二 片 5 5 入  5输
端 产 生 一 低 电* 信 号 .使 第 二 片 5 5 发 , 而  5触 从 在 V0 处 产 生 高 电*, 持 续 时 间 由 R2 2 其 C2乘 积  

光 子 计 数 器 的调 节 主 要 在 于 取 得 台适 的 甑  别 电压 , 得 仅 仅 由光 子 产 生 的 电脉 冲 被 计数 , 使   其 它的 不 计 数 。 心 诃 节 图2 的 甑 别 电位罚 节  精 中 器 , 至 EM9 5 QB曲 直 流 高J 为 i 0 ~ 10   直 58 压 2 0 5  0

决定 。 当 ̄O变 为低 电* 时, 2 在第三片5 5 5 输出端  也产 生一时闯极短的 高电*信号 ( 3 乘积 很  R C3

伏左右 ,计数器 上 由暗 电流弓 起 的读数 每秒 钟  I
为 5~ l 个 即 可 。 O  

,) 经反 相器 2(4 o) J, 、 7 LS o 产生低 电*, 送至 计  数器 控制端 4( 低电*复位  使计 数器 清 。   0。
与此 同 时 在 Vi处 产 生 一 … 电 * ,触 发 第 四  4 0

2 舶 攮 舞 的 安 鼗 和 调 节  .

激发 偏振器和发射 偏振器 的安装和调节 较 
为 困难 。 两 个 偏 振 器 的 主 振 轴是 否 精 确 地 处 在 

水 *或垂直位置 ,能否通过精确 转动9 度而互  o 换 ,是 仪器能否准 侮测定荧光 偏振 的关键。我  们 是 用稀 肝 糖 原 水 溶 液 的 散 射 光 来 调 节 检 验 偏  振器 的位置  糖原 溶液产生的 散射 光百 分之百 
在 垂 直 方 向上 偏 振 , 其 偏 振 值 为 1 0 利 用 这 一  ., 特 点 ,可 先 将 激发 偏 振 器置 于 垂 直 位置 ( 要  不 求 十 分 精 确 ) ,诃 节 发 射 偏 振 器 位 置 ,直 至 读 

圈 4 时 基控 柳 电路 
C. j F Cl 1 D ̄F     : 0 t   C C3.   { l 2. C4 0gF  

数最小 ,此 时发 射偏振器即处 于水 *位置 ( 读  数 用 I 示 ) 。 再将 发 射 偏 振 器 转 动 0  表 0度 ,细  调 ,直 至获得 最大读数 (   用I 表示),此 时 发 
射 偏振 器处 于 垂 直 位置 。 后 调节 激 发 偏 振 器 . 然   先 将 发 射 偏 振 器 调 至垂 直 位 置 ,再 调 节激 发 偏 

R: t o Q  RI 1 0 o k ̄ : 0 kD ̄ l M    0

R R3 R4  o kO  2. , I 0.

片 5 5 R4 乘 积 极 小 ,V0 5, C4 4很快 由 高 电 乎变  为 低 电半 , CL椽 出端 产 生 一 负 跳 变 信 号 送 至  在

振器 位置 ,读教 最太时为垂直 位置 ;再转 动 9  0 度 ,读 数 最 小 时 为 水 * 位 置 。 为 了 检 验 两 个 偏  振器 的位置是否 合适,可测定糖 原溶 液 的偏振 
值 。 将 I和 I代 入 下 式 即 可 求 得 偏 振 值 。      

第 一片5 5 5 输入端 ,作为 触发 信号, 开始下一 次 
计数 。 际 上 第 四片 5 5 第 三 片 5 5 生 的    宴 :对 5 5产 0 信 号 起 了延 时 作 用 ,使 清 “0 和 开 始 计数 信    号 有 一定 的 时 间 差。  

P (  = I 一G×I)/ (Ⅳ 工 I +G×I) 上  
其 中 G是 发 射 偏 振 器 在 水 * 和 垂 直 方 向上  的光 学 校 正系 数 。 激 发 偏 振 器 置 于 水 * 位 置 , 将  

从上述 电路 可知 ,计数时 间 ( 取样时 间)   的长 短 出 R1 决 定 , 两 次计 数 之 间的 时 间 问  Ci 而 艏主要 由R C 决定。 间长 短可 根 据需 要进 行  2z 时
调 节 , -般 为 2 左 右 。 这 段 时 间 可 用 来记 录  一 秒 数 据, 改变 激发 偏 振 器 或 发 射 偏 振 器 的 位 置 等 。   在 我们 的荧 光 测 试 中,对 取样 时 间 的准 确 性 要  求 不 高 ,只 列 同一取 样 时 问 的 稳定 性 有 一定 要  求。 测 试 结果 表 明, 5 5 成 的 上 述 时 基 电路  由 5组
可 以满 足 要 求 。  

测定发 射偏振器垂直方 向上 的 读 数 ( I  )和 

水 *方 向上的 读数 ( r ,由下 式 可 得 G:  )   G=I /h h I    
当P 太于0 9时 即可 认 为两 偏振器 位置  值 。7 正确 ,否 则要重新 调节 ,直至散射光 偏振值达 
到要 求 为 止 。   激发 光 源是 氲 灯 , 激 发 偏 振 镜 光 谱 范 围  是 2 0 8 0 m,发 射 偏 振 片光 谱 范 围是 3 0 0 ̄ 0 n 。 ~ 

19 年 第 2期    2 9







器 

0  

8 O m,故适 用于绝大部 分生 物 样 品的研 究。 5h   我们 用费 光偏振仪测试 了一系列 生化 样 品,如  1& DN  ̄ ,- S GAP DH ( 一 3 磷酸甘 油 醛脱  氢酶) B A( , S 牛血清 白蛋 白) 等, 结果 与文 献报  导 一 致 。 我 们 还 用 这 台仪 器 研 究 了 b S ANS i_  
 ̄T 帕 影响等 ~


cne p c ocp ,C a tr 9 e   ec  Set s y h pe r o   .N w Y r Pe u    s 9 3 ok: ln m P es 8  r ,I 2 u : ag 。g     K n    ,Wee  .B oh m   brG ie e - 7 99 8  ,18,2" : 。 R     五 gc g   。       ,w  G?B。h 皿 一   。。   

I 相    皇 M 三 ! 苎   


取 了 少 意 的 果   得 不 有 义 结 “。
参 考


酶  

最( 发 ) …… ‘ ’  表 即     
解 离.生 物物 理学 报 ( 即将 发表 )  

。  嚣

相 踟



生物物 



献 

5 阮康 成 ,张 庭 芳.丙 酮 馥 氧化 酶在 高压力 下 的    

1  

La o e    R k wi z J

P i r nci es pl  of Pl   uor r e ̄ 

⑦ 
r f —J  

聚 醚三 酰 胺 钠 离 子 电极 的 制备 和 应 用 
壁 l 钱国英 郭荣根。  

谭 担l权 千  天  焦
( 国科 学 院 兰 州 化 学 物 理 研 究所 . 兰 卅 中 k 7 o 0 ) 5 o o 

2孑 . 

中 国科 学 院 青 海 盐{ 胡研 究 所 ,西 宁 . 8io 8     o) o



要:用 五 种台戒 的开 链聚 醚三 酰胺 制成 了PVc 膜钠 离子 电极 ,并 与类 似 结构 的E T丑2 电极作  盯

丁 比较。 研 究了 载 体结构 与 电极 性能 的关 系 , 含有适 当长度 碳 链 | 几 种酰 胺适 于 怍钠 电设 拘 栽体 。 P   趵 VC 涂层 玻 璃疆钠 电极 性 能 良好 ,可 用 于嵌 复 已失 效 的某 些 玻 璃膜 钠 电极 的功 能。  
t  



选  

体  

用 1 1 1三 [ L ( L氧 杂 一  氧 代 一  , ,- 1 2 4_ 5


氮 杂一  甲基) 5 十二烷基] 烷 (p H2 7 丙 IET 2 ) I   可制得有实用价值 的钠 离 子 选 择 电 极“ 。 ~  
P 涂 层 玻 璃 膜 钠 电极 也 有 过 报 导 [。我 们 利  VC a 『

一 、

实 验和 结果 

I 仪 器 和 试 剂  .

用 国产原 料合成 了五种含醚链 的三 酰胺 ,研究  了 电极 的 性 能 与 载 体 结 构 的 关 系 , 制得 的钠 离  
子 电极 性 能 类 似 ETH2 7 2 电极 。 台 成 的 1 1 1 用 , , 

电位 测 定 用美 国Oro  0 in9 1离 子 计: .pH测 

定 用江 苏 电分析仪器 厂l 1 0 型p H计 。参 比电板  用带0 5 o .d . t 1 m  KC 琼脂 外盐桥 的饱 和甘  o 1
汞 电极 

三 [  ( 氧 杂'  氧 代一   氮杂~   丁  1 2   4 5 5一 基) 壬烷 基 ) 烷 为 中性 载 体 , 邻 苯 二 甲酸 二  丙


下面 ( )~ ( )是 我们 合成 的五种 含  1 5
醚 链 三 酰 胺 载 体 ,合 成 方 法 详 见 文 献 [ 。 与  4]

辛 酯 (  ) 增塑剂的 P DOP 为 VC涂层玻 璃膜钠离  子 电极 性能 良好 , 用 此 法 可 恢 复 某 些 失 效 的玻 
璃 膜钠 电极 的 功 能 。  

( 6)E H2 7 T 2 载体 类似 , ( ) ~ ( ) 为  1 5均
微 棕黄 色 粘 液。  

? 现在 浙江省 嘉  市环 境监 涮站 工 作.     青 海医学 院附属 医院邱丽 萍辱 同志参加 部分工 作 




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